Файл можна обробляти подібно до інших iterable, таких як список, кортеж, діапазон, генераторні послідовності тощо.
Таким чином, файл можна передати як параметр циклу for, генератора списків, функції map і т.п. — файл буде розбито на рядки, до кожного рядка можна буде застосувати якісь дії, а результат оформити як список.

Спершу розіб'ємо кожен рядок на поля. Нам пощастило: поля розділені пробілами й самі пробілів не містять, тому це можна зробити, використовуючи метод str.split():

content=[s.split() for s in f] 

В результаті, отримуємо список списків приблизно такої структури:

[['00:00:00.311',      '445.011'],
 ['00:00:01.311',      '965.649'],
 ['00:00:02.311',      '461.963']] 

Далі, якщо нам треба кожен стовпчик винести в окрему змінну, треба розвернути цей список з допомогою функції zip() і присвоїти двом змінним:

a, b=zip(*content)

Змінним a та b буде присвоєно вміст, відповідно, лівої та правої колонок в вигляді кортежів рядків.
Усе разом:

with open('file.txt', 'r') as f:
    content=[s.split() for s in f]
    a, b=zip(*content)
    print(a); print(b)